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  尽管 KEGG、REACTOME 等数据库已体系收录了很多已知代谢反响，渐渐的变多的根据阐明，咱们对活细胞中实在运转的代谢网络的了解仍仅触及“冰山一角”。

  现在仍有超越 30% 的人类基因功用未被清晰注释，其间适当一部分被估测编码代谢相关酶类。尽管无拘无束体外酶活性的代谢组学挑选技能可用于发现不知道反响，但其回收率遍及较低(一般低于 20%)，难以完成体系性掩盖，且大都反响无法在生理环境下得到验证。这些“缺失”的反响构成了代谢网络中的“暗物质”，严峻限制了咱们对细胞生理及疾病机制的体系性认知[1]。

  值得重视的是，研讨开发的 IsoNet(Isotopologue Similarity Networking)战略，经过整合安稳同位素示踪代谢组学与同位素异构体方式类似性网络剖析，可在无先验假定的前提下，直接从活细胞及动物体内揣度并验证不知道代谢反响。该办法无需酶纯化，有用规避了体外挑选的低回收率瓶颈，明显拓宽了可检测反响的类型与规模——包含非酶促反响。经过体系构建同位素类似性网络，IsoNet 完成了代谢反响的高通量发现与功用解析，为制作完好代谢图谱、提醒代谢通路在生理与病理过程中的效果供给了强壮的无偏倚东西。

  在代谢反响网络中，反响过程超越 7 步的代谢物对被界说为非反响对。原始数据以源数据文件的方式供给（图 1）。

  图 1.在安稳同位素示踪代谢组学中，反响相关的代谢物往往具有类似的同位素异构体方式。

  A. 代谢反响相关代谢物生成示意图及其同位素异构体方式类似性核算。B. 在用全碳13 符号谷氨酰胺或 全碳13 符号葡萄糖符号 17 小时的 293T 细胞中检测到的符号代谢物和反响对的数量。C. 在用全碳13符号谷氨酰胺符号的 293T 细胞中，反响相关代谢物 (天冬酰胺/天冬氨酸和天冬氨酸/乳清酸) 的同位素异构体方式类似性评分 (SISO) (每组 n = 6 个生物学重复)。数值表明平均值 ± 规范误。D. 在用全碳13符号葡萄糖符号的 293T 细胞中，反响相关代谢物 (谷氨酸/α-酮戊二酸和 α-酮戊二酸/顺式乌头酸)的同位素异构体方式类似性评分 (SISO) (每组 n = 6 个生物学重复)。数值表明平均值 ± 规范误。E.在用全碳13符号谷氨酰胺或全碳13符号葡萄糖符号的 293T 细胞中，反响对 (RP) 和非反响对 (non-RP) 中两种代谢物具有高同位素异构体类似性评分 (SISO≥ 0.7) 的百分比。

  研讨发现，在安稳同位素示踪试验中，具有直接生化转化联系的底物与产品，其同位素异构体散布方式(isotopologue patterns)高度类似。无拘无束此，团队开发了同位素方式类似性评分(SISOscore)，并以此构建代谢物间的相关网络，从而在全代谢组层面无偏倚地揣度潜在代谢反响。

  在 HEK293T 细胞、小鼠肝脏及诱导性骨髓来历巨噬细胞(iBMDM) 中，IsoNet 共揣度出数百对具有高置信度的代谢物转化联系，档次氧化复原、基团搬运、水解、衔接等多种反响类型。其间很多反响未被收录于 KEGG、HMDB 或 MetaCyc 等干流代谢数据库。

  研讨聚集于谷胱甘肽(GSH)相关代谢网络，发现 GSH 可经过一种新式转硫反响(transsulfuration)，将其半胱氨酸残基替换为丝氨酸，直接生成新代谢物 γ-谷氨酰-丝氨酰-甘氨酸(γ-Glu-Ser-Gly)。该根据成果得出，谷胱甘肽不仅是经典抗氧化剂，还可作为内源性硫供体参加代谢调控。这一发现挑战了传统以为 γ-谷氨酰三肽仅经过 ATP 依靠的衔接酶组成的认知。

  这些全碳 13 符号化合物，掩盖了糖酵解、TCA 循环、氨基酸代谢和谷胱甘肽组成等要害代谢通路，使研讨者能够根据碳 13 符号原子体会其在杂乱网络中的去向。

  与传统同位素试验只验证单条假定通路不同，本研讨重视的是一切代谢物的同位素散布形状。只需两个代谢物在细胞中存在直接反响联系，它们的同位素“指纹”就会出现高度类似性，这正是 IsoNet 的逻辑根底。这也是 IsoNet 对试验成果做剖析的重要根据。

  从研讨者规划的试验操作来看，该研讨为安稳同位素示踪供给了一个可仿制、可扩展的范式，也为后续的研讨供给了较好的辅导典范，以下为以细胞为例作者做试验的具体流程：

  细胞系：293T 细胞、iBMDM(永生化骨髓源性巨噬细胞)等。培养基：运用含 10% 透析胎牛血清(dFBS)和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM。符号机遇：细胞成长至 80% 汇合度时更换为含同位素符号物的新鲜培养基。符号时刻：一般为 17 小时(可根据试验调整)。

  快速移除培养基，用 PBS 洗刷细胞两次。置于干冰上，参加预冷的代谢提取液(甲醇/水 = 80/20，V/V)淬灭代谢。 ?80 ℃ 孵育 40 分钟。刮取细胞并搬运至离心管，再用 400 μL 提取液清洗培养皿，兼并提取液。涡旋 1 分钟，4 ℃、16200 × g 离心 10 分钟，取上清。如测定半胱氨酸等易氧化代谢物，可取部分上清进行 N-乙基马来酰亚胺(NEM) 衍生化处理。剩下上清在线. 样本前处理

  A. 同位素类似性网络构建：核算代谢物对的同位素方式类似性得分 (Siso)。结合 MS/MS 谱图类似性(余弦得分)。构建网络：节点为符号代谢物，边表明 Siso 0.7 且 MS2类似性 0.5。

  B. 反响揣度与注释：运用 KEGG 反响库和Delta Mass 库匹配代谢物对的质量差(Δm/z)。揣度反响类型(如氧化、搬运、水解等)及原子差异。

  A. 化学规范品验证：组成新发现代谢物(如 γ-Glu-Ser-Gly、S-乙酰谷胱甘肽等)。经过保存时刻、MS/MS 谱图及核磁共振(NMR)比对承认结构。

  B. 能与机制验证：抑制剂处理：运用 BSO(谷胱甘肽组成抑制剂)验证代谢物与谷胱甘肽代谢通路的相关。基因敲降：经过 siRNA 敲低 GCS(谷氨酰半胱氨酸组成酶)，调查代谢物水平改变。体外反响验证：在无酶体系中孵育底物(如谷胱甘肽 + 乙酰辅酶 A)，验证非酶促反响。分类为已知反响、I 型不知道反响(已知-不知道代谢物对)、II 型不知道反响(不知道-不知道代谢物对)。

  IsoNet 处理的问题：打破“已知代谢物-已知反响”的研讨鸿沟；将安稳同位素示踪从假定验证东西晋级为无偏倚发现引擎；体系提醒非经典、非酶促或低丰度代谢反响。